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Nisina en productos cárnicos para inhibición de Listeria monocytogenes

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Nisina en productos cárnicos para inhibición de Listeria monocytogenes: revisión de trabajos realizados en la Argentina 

Listeria monocytogenes, bacteria Gram positiva, ubicua, psicrótrofa, anaerobia facultativa, es el agente etiológico de la listeriosis. Esta enfermedad, que puede ser transmitida por alimentos, produce severos problemas de salud pública, con incidencia de riesgo sanitario dramático, tanto en embarazadas, en las que puede provocar abortos prematuros, con septicemia o meningitis; como en adultos mayores, en los que puede generar meningitis y/o encefalitis. La bacteria puede sobrevivir en condiciones relativamente extremas, tales como temperaturas bajas (mínima de – 0,4ºC) o altas (máxima de 45ºC), bajo pH (4,4), actividad de agua reducida (Aw = 0,92) y alto contenido de sal. Debido a su carácter psicrotrófico, es un patógeno de interés en los alimentos refrigerados como por ejemplo, los productos cárnicos. Una estrategia para su control que se está empleando en diversos países para la elaboración de este tipo de productos es la adición de nisina como complemento antibacteriano natural, a fin de reasegurar la inocuidad alimentaria y superar, fundamentalmente, la tolerancia a la baja temperatura, y eventuales descuidos en la manipulación higiénico-sanitaria del producto final antepackaging.

Ricardo A. Sobol1; Silvia Raffellini2; Verónica Berges Soubies3
1LAS-ICMSF. Universidad Tecnológica Nacional – UBA. Argentina.
2Universidad Nacional de Luján. Luján, Buenos Aires, Argentina.
3Universidad Argentina de la Empresa. Buenos Aires, Argentina.

El objetivo de este trabajo es revisar los antecedentes referidos a la inclusión de la nisina en la legislación alimentaria argentina, y su utilización en el país como antimicrobiano natural para controlar el crecimiento de Listeria monocytogenes en los alimentos, con énfasis en productos cárnicos cocidos, ya sea mediante por su agregado directo y/o a través de la sinergia con factores intrínsecos y/o extrínsecos de crecimiento para la formación de efectos barrera que ayuden a la inhibición de la multiplicación microbiana y a asegurar el consumo inocuo de alimentos.

Palabras clave: Nisina; productos cárnicos; Listeria monocytogenes

Antecedentes de la inclusión de la nisina en la legislación alimentaria argentina

En la Argentina, la nisina ha sido aprobada para su uso en alimentos a partir de un brote de botulismo acaecido por el consumo de quesos fundidos en el año 1974 (de Lagarde, 1974; Briozzo et al., 1983). La industria láctea fabrica quesos fundidos con el sabor propio de la mezcla de los distintos quesos que normalmente intervienen en su fabricación.  Durante la elaboración, estos productos se calientan a una temperatura que no supere los 80 °C, tratamiento térmico equivalente a una pasteurización, para producir el fundido de los quesos y el mezclado homogéneo. Posteriormente el queso fundido se envasa para su comercialización y se conserva bajo refrigeración.

Este tratamiento térmico en la fabricación alcanza sólo para eliminar las bacterias banales y las patógenas no esporuladas que pudieran estar en la mezcla. Si se descuida la temperatura de refrigeración en la conservación de los quesos fundidos, en caso de haber bacterias esporuladas, estas pueden generar gases que deterioran la calidad del producto. Esto suele dar lugar a la existencia de reclamos a las empresas elaboradoras por la formación de gas, que deteriora la calidad de presentación del producto, con hinchamientos y, a veces, con olores nauseabundos generados por bacterias del genero de Bacillus spp y Clostridium spp resistentes a las temperaturas de pasteurización.

En la década del ’70, en Argentina la industria quesera comenzó a desarrollar estos quesos fundidos con el agregado de sabores, vegetales desecados y también con vegetales frescos molidos que le daban un flavor especial de acuerdo al vegetal ingresado a la mezcla inicial del queso a fundir. Así, por ejemplo, una importante empresa quesera de plaza, comenzó a fabricar queso fundido con el agregado de cebolla cruda molida.

Algunas de las operaciones para su fabricación consistían en limpiar, moler la cebolla cruda, desinfectarla y luego introducirla a la mezcla de los quesos en fundición, homogeneizándola y pasteurizándola como se estaba haciendo normalmente. Dado que la pasteurización elimina parcialmente la carga microbiana vegetativa, pueden quedar viables esporas de microorganismos más resistentes al calor que implican algún riesgo sanitario.

Precisamente esto ocurrió con una partida de estos quesos que se comercializaba en el mercado: se comenzaron recibir algunos reclamos de personas que, luego de consumirlos, manifestaban señales de botulismo, como dificultad para tragar o hablar, boca seca, debilidad facial a ambos lados de la cara, visión borrosa o doble, los párpados caídos, dificultad para respirar (ataca el diafragma), náuseas, vómitos y calambres abdominales y parálisis. Se originó un brote importante con una docena de casos fatales. Tanto la empresa como las autoridades de fiscalización sanitaria, se volcaron de inmediato a una dificultosa recuperación de las unidades de estos quesos, ya que, en esa época, no estaban planificadas las medidas para el retiro rápido de alimentos en el mercado, cuando se presentaran riesgos para la salud (recall), y los comercios eran un sinnúmero de almacenes pequeños y fiambrerías distribuidos por el país, antes de la era del advenimiento de los supermercados.

La causa raíz del problema estuvo en la fallida limpieza y eventual falta de adecuada desinfección de un bulbo que está debajo de la tierra con la posibilidad de arrastrar esporas de Clostridium botulinum a la mezcla de los quesos que luego de fundidos, no alcanzaron las temperaturas necesarias para destruir la presencia de las esporas de este microorganismo presente. El proceso térmico aplicado para el fundido destruyó toda la flora microbiana no esporulada presente y dejó libre la posibilidad de que las bacterias esporuladas empezaran a multiplicarse y generar toxina botulínica. Esto sucedió cuando se mantuvieron los quesos a temperaturas de refrigeración posiblemente no adecuadas, o sin refrigeración, y dentro de una masa de queso muy anaerobia, justamente por la cocción de su fabricación, germinaron las esporas y se transformaron en formas vegetativas. Con la actividad de agua muy baja, el pH neutro, los nutrientes presentes en el queso y la extrema falta de aire, las bacterias empezaron a multiplicarse y generar toxinas.

A raíz de este importante brote y ante la emergencia, Salud Pública de la Nación, acepta el agregado de la nisina como aditivo de conservación para proteger al consumidor, al inhibir el crecimiento de esporas de Clostridium botulinum que pudieran estar contaminando este tipo de quesos y, además, de otros anaerobios esporulados que deterioraban la calidad.

Consecuentemente, en aquel momento, la Firma ESCO S.A. obtuvo la representación exclusiva de la firma internacional APLIN & BARRETT para la distribución de la nisina con la marca NISAPLIN® en Argentina.

Con el agregado de la nisina como conservador en los quesos fundidos se logra la interferencia necesaria para impedir el crecimiento de las bacterias esporuladas gram positivas que pueden alterar la calidad de estos quesos y además inhibir el crecimiento de bacterias esporuladas patógenas como el C. botulinum.

El uso de la nisina en la industria alimentaria fue ratificado en los principales centros internacionales de distintos países, generándose numerosos trabajos científicos sobre sus propiedades antibacterianas. Sus características también fueron reconocidas y definidas por el Comité Conjunto Experto de la Organización Mundial de la Salud (WHO) y la Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO).

En nuestro país, la nisina fue evaluada en el Instituto Nacional de Farmacología y Bromatología – INFyB (actual Instituto Nacional de Alimentos – INAL) y luego considerada por la Comisión Nacional del Código Alimentario Argentino, que en noviembre de 1983 aprobó su inclusión en el mencionado Código Alimentario a través del Acta Nº 50 del 24 de noviembre de 1983. Posteriormente esta Acta fue protocolizada por el Ministerio de Salud y Acción Social de la Nación con la Resolución Nº 1.130 del 12 de julio de 1985, incorporando a la Nisina en el Código Alimentario Argentino.

La nisina en el Código Alimentario Argentino

En Argentina, actualmente la nisina está permitida como conservador para ser utilizada en diversos productos lácteos, según se consigna en varios Artículos del Capítulo VIII – Alimentos Lácteos del Código Alimentario Argentino, a saber:

Aspectos técnicos generales de la nisina

La nisina está reconocida internacionalmente como un agente antimicrobiano bien definido, muy efectivo, de baja toxicidad y una historia demostrada de uso inocuo. La nisina es producida por fermentación microbiana en la fase exponencial de crecimiento de Lactococcus lactis subsp. lactis. que es un reconocido cultivo iniciador en productos lácteos (Delves-Broughton & Gasson, 1994).

El uso de nisina está actualmente aprobado en varios países del mundo en una amplia variedad de productos alimenticios, incluido el queso y los productos del queso, postres lácteos, hortalizas y sopas en conserva, y productos de panadería. La eficacia del uso de nisina como agente antimicrobiano en los alimentos ha sido bien documentada. Gill & Holley (2003) probaron el efecto de diversos compuestos (solos o combinados), entre estos la nisina y el nitrito de sodio, sobre el crecimiento de diversos cultivos de bacterias gram negativas y gram positivas de interés para productos cárnicos. Mientras la nisina ha sido eficaz en la inhibición de bacterias ácido lácticas y Listeria monocytogenes, el nitrito no inhibió eficazmente el crecimiento de todas las cepas de bacterias ácido lácticas probadas y su efecto inhibidor sobre la listeria ha sido inferior a la nisina.

La nisina es efectiva contra bacterias gram positivas y se ha demostrado también que es efectiva contra bacterias gram negativas cuando se aplica como parte del enfoque de la tecnología de obstáculos (aplicación simultánea de varios procedimientos o barreras) para la inocuidad y preservación de los alimentos. La nisina inhibe los microorganismos alteradores, incluidas las bacterias de deterioro del ácido láctico, ayudando a prolongar el período de validez y mantener la calidad del producto. También se utiliza cada vez más como una intervención primaria para desactivar o inhibir el desarrollo de microorganismos patógenos en los alimentos, como Listeria, Staphylococcus y Mycobacterium, y las bacterias de formación de esporas Bacillus y Clostridium, ayudando a aumentar la inocuidad del alimento. La dosis de nisina necesaria para obtener el efecto deseado depende de varios factores, que incluyen el procesado y las condiciones de almacenamiento, las materias primas utilizadas, la carga bacteriana y la formulación del producto a elaborar.

 Sobre la base de los resultados obtenidos por numerosos investigadores, la nisina es una alternativa de interés tecnológico para ser empleada, por sus características químicas y por su potencial antimicrobiano, en la carne y productos cárnicos, incluidos los de aves de corral. Las bacterias gram positivas asociadas con los productos cárnicos procesados tienen (a diferencia de muchas bacterias gram negativas) una tolerancia relativamente alta de la actividad acuosa reducida, temperaturas de refrigeración, bajo pH y la presencia de sales emulsionantes de nitrato y fosfato. Además, mientras las temperaturas utilizadas en el procesado son suficientes para matar la mayoría de bacterias, no son efectivas contra esporas termorresistentes. Las carnes procesadas son también propensas a la contaminación posterior al procesado durante las operaciones de corte y envasado. El crecimiento de organismos de deterioro acorta el período de vida útil de los productos cárnicos procesados, incluso a temperaturas de refrigeración. Este tipo de productos son también especialmente susceptibles al rápido deterioro a consecuencia de un almacenamiento a temperaturas de abuso (mayores que la temperatura de refrigeración). Bacterias de deterioro comunes en productos cárnicos procesados son, por ejemplo, las bacterias gram positivas de ácido láctico, que dan lugar a la producción de mucosidades de superficie (limo), decoloraciones, gases y olores desagradables. Sin embargo, la contaminación por Listeria monocytogenes, que tiene una alta resistencia al calor y, además, puede crecer a temperaturas de refrigeración pues es una bacteria psicrótrofa, es de mayor preocupación. La nisina, especialmente cuando se utiliza en combinación con otras tecnologías (efectos barrera), es efectiva a dosis bajas de uso, para prevenir o retrasar el crecimiento de estas bacterias en los productos cárnicos procesados. Estudios demuestran que es efectiva para inhibir el crecimiento de Listeria monocytogenes cuando persiste en el alimento después del procesamiento. Por tanto, el uso de nisina en estos alimentos mejorará la protección contra el deterioro bacteriano, beneficiando a los consumidores, el comercio al por menor y los fabricantes de alimentos, mediante la reducción de pérdidas de productos, aumento del período de vida útil y ayudando a la salud pública y a la inocuidad.

Experiencias realizadas en Argentina que pueden relacionarse con la aplicación de nisina en matrices cárnicas para la inhibición de Listeria monocytogenes

 Como se ha reportado en secciones previas, en Argentina la nisina es una aditivo de uso aprobado en Código Alimentario Argentino para la elaboración de quesos procesados, por lo tanto en esta instancia, se ha dirigido la búsqueda de información hacia los trabajos realizados en el país en los cuales se haya estudiado la actividad de la nisina aplicada en productos cárnicos y en especial, su capacidad de inhibición contra Listeria monocytogenes, en vistas a la ampliación de su utilización a matrices alimenticias de origen no lácteas. Se reportan además algunas experiencias realizadas en el país con nisina aplicada en otras matrices diferentes (se exceptúan los trabajos en matrices lácteas por el hecho de que en las mismas ya está suficientemente documentada su efectividad) y cuyos resultados podrían extrapolarse, con las debidas reservas, a las matrices cárnicas.

Existe a nivel internacional una prolífica bibliografía en la que se ha reportado la actividad antilisteria de nisina (Muriana, 1996; Cintas et al., 1998) y sus limitaciones, como por ejemplo la naturaleza cepa-dependiente de la sensibilidad (Ukuku et al., 1997) y la relativamente alta frecuencia con la que suele producirse el desarrollo de tolerancia y o resistencia a la bacteriocina (Harris et al., 1991). Si bien estas características podrían considerarse una limitación para la aplicación de bacteriocinas,  existen innumerables trabajos en los que se ha comprobado la efectividad antimicrobiana de la nisina en alimentos (información recopilada en revisiones como la recientemente efectuada por Gharsallaoui et al., 2015), e incluso trabajos en los que, específicamente en matrices cárnicas, se estudió el efecto inhibitorio de la bacteriocina ya sea sola o en combinación con otros factores de stress que complementen su acción y que potencien su actividad (Gharsallaoui et al., 2015, Huq et al., 2015).

Sin embargo, las experiencias realizadas en Argentina pueden presentar como valor adicional el hecho de haber sido realizadas en matrices alimenticias originadas en el país, bajo sus propias condiciones ecológicas que pueden aportar características diferenciales a los productos, y con microbiotas específicamente adaptadas a estos nichos, que por tal motivo podrían presentar mayor resistencia ante los factores de stress a los que son expuestas.

Si bien se han realizado en el país numerosos trabajos en los que se evaluó la capacidad inhibitoria de la nisina, son escasas las investigaciones que hasta la fecha se han localizado en las cuales se ha aplicado la bacteriocina en productos cárnicos de origen vacuno, en las que, además, el efecto microbiano sea evaluado sobre Listeria monocytogenes. Estos trabajos han sido realizados en forma preponderante en el Centro de Referencia para Lactobacilos (CERELA), Instituto del CONICET, localizado en la ciudad de Tucumán, específicamente por el equipo de investigación que dirige la Dra. Graciela Vignolo.

Por otra parte, otros grupos argentinos de investigación han evaluado la actividad de la nisina en matrices alimenticias no lácteas, aplicada sola o en combinación con diferentes factores de stress o incluida como aditivo conservador en películas, y sus resultados pueden ser de utilidad para la industria cárnica. En ese sentido se destacan  los trabajos realizados en otras instituciones argentinas como por ejemplo:

  • Universidad de Buenos Aires (UBA), específicamente en el Dto. de Industrias (Facultad de Ciencias Exactas y Naturales – FCEyN) y el Dto. de Ingeniería Química (Facultad de Ingeniería – FI), localizados en Ciudad Universitaria, por los equipos de investigación liderados por las Dras. Carmen Campos y Rosa Jagus, respectivamente.
  • Universidad Nacional del Chaco Austral, por el equipo dirigido por el Dr. Oscar Garro.
  • Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA), por el equipo dirigido por el Dr. Marcelo Masana, en el Instituto de Tecnología de Alimentos.
  • Instituto Nacional de Tecnología Industrial (INTI-Plásticos), por el equipo dirigido por la Dra. Patricia Eisenberg.

Trabajos realizados por investigadores del CERELA

CERELA es una institución argentina de excelencia, líder en Latinoamérica en investigaciones referidas al estudio de las bacterias lácticas. Posee un importante banco de cepas autóctonas de bacterias lácticas, las cuales son estudiadas exhaustivamente para profundizar su conocimiento tanto de los aspectos básicos como sus posibilidades de aplicación industrial.

Los trabajos realizados por el equipo liderado por la Dra. Graciela Vignolo, que están focalizados hacia la utilización de la cepas autóctonas de bacterias lácticas aisladas en el país o sus metabolitos como agentes bioprotectores para prolongar la vida útil de productos cárnicos. Por consiguiente, la mayoría de sus trabajos se basan en empleo de cepas autóctonas de Lactobacillus sp. o Lactococcus lactis subsp. lactis y de las bacteriocinas que ellas producen, y básicamente se utiliza nisina comercial en combinación con los productos autóctonos o bien como patrón de referencia para comparar poder inhibitorio.

En los primeros trabajos realizados, Castellano et al. (2001) evaluaron el efecto de la nisina (marca comercial Nisaplin®, 2500 UI/ml) sobre 5 cepas de Listeria monocytogenes, inoculadas en medios de cultivo líquido (cargas bacterianas de 3 y 7 log/ml) a diferentes pH (5, 6 y 7) e incubados 24 horas a 20 °C. En estas condiciones se corroboró que la sensibilidad hacia la nisina era cepa-dependiente, y se obtuvieron pérdidas de viabilidad que fluctuaron entre  1,5 – 1,8 log, con un máximo de 3 log a pH 5, lo cual demostró la existencia de células de listeria que sobrevivieron al tratamiento con nisina.

Con el objeto de potenciar la actividad inhibitoria de la nisina y de superar la aparición de células de Listeria monocytogenes nisina-resistentes, se desarrollaron investigaciones en las cuales se combinaron nisina comercial con otras bacteriocinas (Vignolo et al., 2000) o con cultivos lacticos bioprotectores (Schillinger et al., 2001). Vignolo et al. (2000) evaluaron la capacidad de las bacteriocinas lactocin 705 (producida por la cepa autóctona Lactobacillus casei CRL 705), enterocin CRL 35 (producida por la cepa autóctona Enterococcus faecium CRL 35) y  nisina (Nisaplin, 2000 UI/ml), en forma individual y combinadas, para inhibir el desarrollo de Listeria monocytogenes y Listeria innocua en medio de cultivo líquido y en sistemas cárnicos. En medio líquido, ante las bacteriocinas evaluadas en forma independiente, ambas especies de Listeria mostraron una disminución inicial del recuento de células viables seguido por el desarrollo de los sobrevivientes después de una hora de incubación. Una mayor actividad antilisteria se observó cuando se combinaron las bacteriocinas en pares, sobre todo si nisina estaba incluido en el par. Cuando se evaluó el “mix” de las 3 bacteriocinas, no se observaron sobrevivientes después de 24 h de incubación. Se obtuvieron resultados similares en sistemas cárnicos (carne fresca magra, picada asépticamente) inoculados con L. monocytogenes (105 células/g) e incubadas 24 h a 20 °C. La nisina (dosis de 2000 UI/ml) aplicada individualmente tuvo efecto bacteriostático (las cargas microbianas se mantuvieron estables durante el período del ensayo), y tuvo efecto bactericida cuando se combinó con otras dos bacteriocinas simultáneamente (lactocin 705 y enterocin CRL 35).

Con respecto a la combinación de nisina con cultivos bioprotectores, los trabajos realizados por la Dra. Vignolo con investigadores alemanes (Schillinger et al., 2001) demostraron que, en medio de cultivo líquido, cultivos bioprotectores bacteriocinogénicos nisina-resistente constituidos por cepas de Enterococcus faecium y Lactobacillus sakei (106 cel/ml), usados en combinación con nisina (Nisaplin, 100 UI/ml) fueron capaces de suprimir la proliferación de células de Listeria (carga original: 106 cel/ml) que sobrevivieron al tratamiento luego de 7 días de incubación a 10 °C (carga final 102 cel/ml). En el mismo trabajo, se utilizó tofú casero como sistema alimenticio modelo para evaluar el efecto inhibitorio contra Listeria monocytogenes (carga inicial: 102) de la nisina o su combinación con bacterias lácticas bacteriocinogénicas (carga inicial 106), durante el almacenamiento a 10 °C por una semana. En los ensayos en los que se usó solamente nisina, se requirieron 2000 UI/ml para mantener en el límite de detección la carga de Listeria, mientras que en los ensayos con la aplicación combinada de nisina + cultivos lácticos fue suficiente la adición de 700 UI de nisina/ml, para obtener el mismo resultado.  Por lo tanto, se consiguió un mayor efecto inhibidor de Listeria monocytogenes con la aplicación de nisina y cultivos bioprotectores.

Bajo la misma hipótesis de trabajo, Peña et al. (2013) evaluaron el efecto de la aplicación de diferentes bacteriocinas y ácidos orgánicos sobre la vida útil de salchichas envasada al vacío y almacenadas a temperatura de abuso (10 ºC) durante 36 días. Nisina y bacteriocinas producidas por las cepas autóctonas Lactobacillus curvatus CRL705 y Lactobacillus sakei CRL1862, solas o en combinación con ácido láctico y acético (2,5%) se aplicaron por inmersión en salchichas previamente inoculadas con L. monocytogenes (103 UFC/g).  En los tratamientos con bacteriocinas + nisina + ácidos organicos se obtuvieron reducciones iniciales de 1,9 log CFU/g de Listeria, y ya no se encontraron células viables desde el día 6 hasta el final del periodo de incubación.

Trabajos del mismo estilo se han efectuado en productos de pesca y con otros cultivos bioprotectores. Por ejemplo Schöbitz et al. (2006) evaluaron la capacidad inhibitoria de tres sustancias antibacterianas producidas por bacterias lácticas frente a Listeria monocytogenes en medio de cultivo líquido y en salmón ahumado en frío envasado bajo vacío y almacenado a 3,5± 0,5 °C durante 20 días. Cuando se ensayó el efecto de lactocina 705 producida por Lactobacillus curvatus CRL705, nisina (NisaplinTM) y la sustancia tipo bacteriocina producida por Carnobacterium piscicola L103 en forma individual en medio TSB a 25ºC durante 72 h se observó una cinética bactericida con lactocina 705 y nisina. La estrategia más eficiente fue la combinación de las tres bacteriocinas produciendo una disminución de los viables a <10 células/ml. Por otra parte, la aplicación de las bacteriocinas en forma de spray a trozos de salmón mostró un efecto bacteriostático impidiendo el crecimiento de L. monocytogenes hasta los 15 días de almacenamiento. El uso de una combinación de bacteriocinas podría ser un mecanismo efectivo para reducir la presencia de L. monocytogenes en alimentos como salmón ahumado en frío, limitando además la presencia de células resistentes a las bacteriocinas.

Otras líneas de investigación relacionadas con la temática, en lugar de evaluar nisina trabajaron con la aplicación, en la matriz cárnica, de cultivos autóctonos productores de nisina. Así por ejemplo Vignolo et al. (2005), evaluaron el efecto de la aplicación de la cepa autóctona Lactococcus lactis CRL1109 productora de nisina, en la extensión de vida útil de medias reses y recortes bovinos almacenados a 8 °C. Si bien no se evaluó el efecto sobre Listeria monocytogenes, la aplicación de la cepa bacteriocinogénica en forma de spray a medias reses vacunas mostró una disminución en los microorganismos totales (0,74 y 0,71 ciclos log) y coliformes (1,12 y 1,48 ciclos log) para cuartos traseros y delanteros respectivamente, luego de 6 días de almacenamiento y 10 de faena, conservando sus características sensoriales. En recortes vacunos, la impregnación con el cultivo protector mostró un efecto bacteriostático sobre la microbiota total retardando su deterioro en 10 días mientras que en cortes porcinos se observó una disminución de 2,9 log en la población de coliformes a los 15 días de almacenamiento a 8 ºC. Estos resultados podrían ser de interés para aprobar la inclusión de la nisina como aditivo en la industria cárnica. Resultados sumamente alentadores presentaron Castellano et al. (2008) en un congreso de Microbiología que tuvo lugar en Argentina. En su trabajo evaluaron la efectividad de inhibición de cultivos lácticos autóctonos bacteriocinogénicos Lactobacillus curvatus CRL705 y Lactococus lactis CRL1109 usados como cultivos bioprotectores, y de sus bacteriocinas (lactocina 705 y nisina), contra Listeria monocytogenes (102 UFC/g) en hamburguesas almacenadas a 5 ºC. La adición de 106 UFC/g de cada cultivo bioprotector en forma individual a la carne produjo un efecto bacteriostático sobre L. monocytogenes durante la 72 h de almacenamiento a 5 °C bajo condiciones aeróbicas. No se observó efecto sinérgico cuando ambos cultivos se aplicaron en forma conjunta. Sin embargo, cuando se aplicaron sus bacteriocinas liofilizadas se observó la inhibición inmediata del microorganismo patógeno, lo cual demuestra su mayor efectividad en comparación con la aplicación de los cultivos bacterianos que la producen.

En el marco de los estudios empleando cultivos autóctonos, se están realizando también trabajos de investigación para evaluar la efectividad de bacteriocinas producidas por cepas autóctonas (entre ellas nisina) combinada con agentes quelantes (EDTA-Na) para inhibición de Escherichia coli O157:H7, patógeno de interés en industria cárnica en Argentina por su alta prevalencia en el país. Así, ensayando la efectividad en medio de cultivo líquido, la nisina producida por la cepa autóctona Lactococcus lactis CRL1109 ha producido la inactivación total de las cepas más sensibles de E. coli O157:H7 cuando se aplica en forma combinada con 1000 mM de EDTA (cargas iniciales 5 log) y un descenso de la población de 2 log en las cepas más resistentes (Belfiore et al., 2007). Sobre la base de estos resultados, se realizó un trabajo aplicando EDTA (48mM) y los cultivos bioprotectores Lactococcus lactis CRL1109 (productor de nisina) y Lactobacillus curvatus CRL705 (cargas: 107/g) en hamburguesas congeladas de carne vacuna picada, inoculadas con Escherichia coli O157:H7 (102 cel/g) y sometiéndolas a temperatura de abuso (5 °C) durante 9 días.  Los tratamientos simultáneos con cultivos bioprotectores y Na2EDTA produjeron una reducción de 1,62, 1,95, 3,41 y 3,90 log a tiempo 2, 3, 6 y 9 días respectivamente en E. coli O157:H7, comparados con el control. En coliformes autoctonos, con ese mismo tratamiento, la disminución fue de 1,55 log comparada con el control. Pero sin EDTA no hubo inhibición (Castellano et al., 2011).

Trabajos realizados por investigadores de la UBA

 En UBA los grupos de investigación relacionados con la industria alimentaria que han realizado ensayos con nisina en matrices alimenticias no lácteas son los dirigidos por la Dra. Carmen Campos (Facultad de Ciencias Exactas y Naturales) y por la Dra. Rosa Jagus (Facultad de Ingeniería).

Los primeros trabajos realizados con nisina por la Dra. C. Campos estuvieron focalizados hacia su aplicación en sistemas que modelan el efecto de la aplicación de aderezos (emulsiones aceite en agua) para inhibición de microorganismos alteradores habituales en estos productos, como por ejemplo Lactobacillus fructivorans (Castro et al., 2009). La investigación efectuada aporta datos referidos a la incidencia de los diferentes contenidos de grasa y de la estructura física de las emulsiones sobre la efectividad antimicrobiana de la nisina (Novasina®, 0,5g/kg), los cuales podrían ser extrapolados en alguna medida a la elaboración de emulsiones de matriz cárnica.

Más recientemente, el equipo de investigación liderado por la Dra. C. Campos ha trabajado sobre el efecto inhibidor de la nisina (Nisaplin®, Danisco) sobre bacterias alterantes de los productos de pesca (Pseudomonas sp., Shewanella putrefaciens y Lactobacillus plantarum) y sobre Listeria innocua (como subrogante de L. monocytogenes), aplicada sola o en combinación con otros conservantes (quitosano, lactato de sodio y sorbato de potasio). Los valores de mínima concentración inhibitoria (MCI) de nisina, ensayados en caldo Mueller Hinton a pH 5,5, rondaron las 1000 UI/ml (S. putresfaciens: 1075 – L. plantarum y L. innocua: 1183), y no se observó efecto inhibidor sobre Pseudomonas sp. ni efecto bactericida sobre ninguna de las cepas probadas a la mayor concentración ensayada (4300 UI/ml).

Al combinar quitosano con nisina se observó un comportamiento sinérgico sobre la inhibición de S. putrefaciens. Sin embargo, el comportamiento fue aditivo sobre la inhibición de L. innocua y no hubo interacción con L. plantarum (Schelegueda et al., 2012a).

Sobre la base de los resultados obtenidos en caldo, se realizaron ensayos en sistemas alimenticios. Cuando se aplicó un tratamiento combinado de nisina (3000 UI/g) y quitosano (300 ppm) a homogenatos de filetes de merluza (Merluccius hubbsi), inoculados en ensayos independientes con L. innocua y S. putresfaciens (105 UFC/g) e incubados 72 h a 30 °C, se observó una reducción de 2,3 log respecto al control en L. innocua y de aproximadamente 4 log en S. putresfaciens (Schelegueda et al., 2012a). En otro trabajo se evaluó la aplicación de nisina (5000 UI/g) sola sobre la misma matriz alimenticia inoculada con S. putresfaciens (105 UFC/g), pero con pH ajustado a 5,5 y 6 e incubado a 4°C durante 7 días. En esas condiciones, la nisina solo tuvo efecto a pH 5,5, produciendo una reducción de 1 log en la población comparada con el control sin nisina durante el almacenamiento (Schelegueda et al., 2012b).

Con respecto a los trabajos realizados por el equipo de la Dra. R. Jagus, se destacan aquellos en los cuales se evalúa el potencial sensibilizador de la nisina hacia células de Listeria innocua (Lehrke et al., 2011), cuya exposición a la bacteriocina las hace más sensibles a la acción inhibidora del ácido láctico y del ácido cítrico, y aquellos realizados en colaboración con la Dra. L. Gerschenson, en los que se evalúa  la acción antimicrobiana de la nisina incorporada a películas comestibles, las cuales podrían aplicarse a futuro en  alimentos de matriz cárnica (Basch et al., 2011; Carpenco et al., 2011; Ollé Resa et al., 2012, 2014).

Trabajos realizados en otras instituciones argentinas

 En otras instituciones del sistema científico-tecnológico argentino se han realizado trabajos con nisina cuyos resultados podrían extrapolarse a la industria cárnica, con las adecuaciones pertinentes.

En la Universidad Nacional del Chaco Austral, el equipo liderado por el Dr. Oscar Garro está a cargo de diversas líneas de investigación que involucran la utilización de nisina en distintos tipos de alimentos. Este grupo suele realizar trabajos en colaboración con la Dra. G. Vignolo (CERELA) y la Dra. C. Campos (UBA). Entre estos trabajos se destacan el estudio del efecto de temperatura, pH y NaCl sobre la capacidad inhibitoria frente a Lactobacillus fructivorans (Herman et al., 2009) y la determinación de la concentración mínima inhibitoria de nisina a aplicar para inhibir bacterias deteriorantes de embutidos cárnicos cocidos, aisladas a partir de productos regionales elaborados en la provincia de Chaco (Palavecino et al., 2009).

En Argentina se han realizado también trabajos en los cuales se estudió el efecto antimicrobiano de la nisina en tratamientos combinados con tecnologías físicas emergentes. En este sentido, se pueden señalar los trabajos realizados por el Dr. Miguel Galvagno, en los cuales se aplicaron nisina y campos eléctricos pulsantes para la inhibición de E. coli y de la microbiota alterante en cervezas (Galvagno et al., 2007), y los realizados por el Dr. Marcelo Masana en el Instituto de Tecnología de Alimentos de INTA, en los cuales se evaluaron el efecto inhibitorio del tratamiento combinado de nisina y altas presiones hidrostáticas contra Escherichia coli O157:H7 (Cap et al., 2014).

Por último, se destacan los trabajos que se están realizando en el INTI-Plásticos, área Micro y Nanotecnologías, por el equipo liderado por la Dra. Patricia Eisenberg, una de cuyas líneas de investigación se aboca al estudio y desarrollo de materiales con actividad biológica mediante la inclusión de nisina y otras bacteriocinas producidas por bacterias lácticas, a ser empleados en envases activos como barrera para el control de contaminantes y patógenos en alimentos. Así, Correa et al. (2103) han logrado desarrollar películas nanocompuestas biodegradables activadas con nisina que poseen capacidad inhibitoria contra Listeria innocua, y que podrían emplearse como una barrera adicional para asegurar la inocuidad de los alimentos, entre ellos los productos de origen cárnico.

Referencias bibliográficas

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